循环肿瘤DNA（ctDNA）的高通量测序有望实现个性化的癌症治疗。不过，血液中的游离DNA（cfDNA）有限，限制了分析灵敏度。为此，斯坦福大学的研究人员近日开发出一种错误校正方法，能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因。

在周一发表的《Nature Biotechnology》上，研究人员介绍了这种称为集成数字错误抑制（IDES）的方法。它是基于斯坦福团队之前开发的一种ctDNA检测技术，名为CAPP-seq，目前已被罗氏收购。

之前，CAPP-seq技术的检测极限是0.02%，不过许多测序片段都有错误。为了解决这些错误，研究团队首先设计了一种分子条形码策略。许多ctDNA检测开发者也采用这种方案来降低错误率。单链DNA和双链DNA条形码策略都存在，不过都有缺点。双链DNA条形码在降低错误上更佳，但效率不及单链DNA条形码，因此不适合ctDNA量有限的样本。

为此，他们着手设计出一种混合策略。首先，他们设计出测序接头，可用于单链和双链的分子条形码。双链分子的每条链上首先标记一个四碱基条形码，称为索引条形码。接着，他们在两条链的每个接头上添加两个二碱基条形码，称为插入条形码。在测序之后，互补的插入条形码可匹配，重新构建出原始的双链DNA分子。

第二步，斯坦福的团队设计了一种计算工具，可以校正测序或PCR的系统错误。为了实现这一点，他们首先对12名健康成人的样本开展CAPP-seq检测。研究人员报告称，尽管所有种类的SNV都有背景错误，但最常见的是G→T的颠换，而C→T和G→A的错误也有。

他们发现，G→T错误的出现是因为杂交捕获过程中的氧化损伤。他们利用一种计算方法来抑制这些错误。这两种策略的结合，使得错误率下降了15倍，这是通过30个健康对照样本和142个非小细胞肺癌样本证实的。

研究人员也在NSCLS样本上验证了此检测。首先，他们检测了41名晚期NSCLS患者的EGFR热点突变。他们在88个血浆样本中检测到412个EGFR变异，所有变异都已经通过肿瘤活检样本确认。此外，这项检测未检出任何假阳性。

接着，他们在参考细胞系上评估了检测的技术限制。他们创建了参考细胞系混合物，其中变异的等位基因的频率在0.05-1.6%。他们发现，条形码策略和计算校正方法是互补的，结合使用效果更佳。这种方法的理论检测极限是0.00025%。

最后，他们利用这种方法来监控30名NSCLC患者中的突变，这些患者的肿瘤已经过基因分型。研究人员发现，他们能够检测到频率低至0.004%的突变。“据我们所知，这是到目前为止深度测序检测到的最少量ctDNA，”作者写道。（来源：生物通  薄荷）

Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA

Abstract  High-throughput sequencing of circulating tumor DNA (ctDNA) promises to facilitate personalized cancer therapy. However, low quantities of cell-free DNA (cfDNA) in the blood and sequencing artifacts currently limit analytical sensitivity. To overcome these limitations, we introduce an approach for integrated digital error suppression (iDES). Our method combines in silico elimination of highly stereotypical background artifacts with a molecular barcoding strategy for the efficient recovery of cfDNA molecules. Individually, these two methods each improve the sensitivity of cancer personalized profiling by deep sequencing (CAPP-Seq) by about threefold, and synergize when combined to yield ~15-fold improvements. As a result, iDES-enhanced CAPP-Seq facilitates noninvasive variant detection across hundreds of kilobases. Applied to non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, our method enabled biopsy-free profiling of EGFR kinase domain mutations with 92% sensitivity and >99.99% specificity at the variant level, and with 90% sensitivity and 96% specificity at the patient level. In addition, our approach allowed monitoring of NSCLC ctDNA down to 4 in 105 cfDNA molecules. We anticipate that iDES will aid the noninvasive genotyping and detection of ctDNA in research and clinical settings.

原文链接：http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/full/nbt.3520.html